《體外基因修飾系統藥學研究與評價技術指導原則（試行）》

一、前 言

近年來，細胞治療和基因編輯等技術手段蓬勃發展，相關臨床醫療探索不斷深入，為嚴重和難治性疾病提供了新的治療理念和方法。日益增加的臨床需求促進了基因操作新技術的應用和更新。

在人體外，采用基因工程技術構建的修飾系統,可有效地將遺傳物質等轉入特定目的細胞，用于修飾目的細胞的遺傳物質、改變基因表達方式或調節細胞生物特性等。目前， 慢病毒載體、γ-逆轉錄病毒載體等常見用于將嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor, CAR）基因導入 T 細胞，以實現 CAR-T 細胞對腫瘤的靶向殺傷；游離型載體（Episomal Vector）、仙臺病毒載體等可用于將轉錄因子導入細胞，通過重編程獲得誘導多能干細胞，為其衍生細胞產品的生產提供起始原材料。將來，預計會有更多樣的載體設計適用于不同類型的產品。

基因修飾系統種類多樣，載體設計、制備過程以及質量控制等方面的差異直接影響到最終產品的安全性和有效性， 且其來源可能不同，質量管理體系存在差異。為保證基因修飾系統質量符合臨床應用的要求，需對其進行充分的質量研究。因此，有必要細化不同類型基因修飾系統藥學研究的技術要求。

本指導原則基于當前的科學認知，針對體外用基因修飾系統提出申報上市階段的建議性技術要求，旨在為研發單位 提供指導意見，同時，也作為監管機構評價的重要參考。本 指導原則不具有強制性，若有可替代或適用的其他研究方法， 或本指導原則中有不適用的內容，申請人/持有人可提供相 應說明及相關替代研究的支持理由和依據。隨著技術的發展、認知的深入和經驗的積累，針對本指導原則內容后續將逐步 修訂和完善。

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二、適用范圍

本指導原則中，基因修飾系統指在人體外，將外源基因等導入細胞，通過添加、替代、補償、阻斷、修正特定基因從而為獲得細胞治療產品或細胞治療產品生產用種子細胞而使用的修飾系統。可能的作用機制包括細胞內表達功能性目的基因，或采用基因敲除、修復、插入等核苷酸編輯方式改變特定的基因序列等。

目前，基因修飾系統包括慢病毒、γ-逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、仙臺病毒等病毒載體，以及 DNA、RNA、蛋白質和蛋白質-RNA 復合物等非病毒基因修飾系統。本指導原則對病毒載體類和非病毒載體類兩類基因修飾系統進行論述。隨著本領域技術的不斷更迭，新的基因修飾系統也可能應用，如適用，其藥學研究也可參考本指導原則。

三、一般原則

基因修飾系統的設計合理性、工藝穩定性、質量可控性可直接影響細胞終產品的安全性和有效性，是藥學研究的重點。需要開展的藥學研究，可能包括上游設計、制備工藝、質量研究與控制、穩定性研究等多個方面。基因修飾系統的制備全過程原則上應符合藥品生產質量管理規范（GMP） 的要求，具體的要求根據其使用情形的不同可具體問題具體分析。

基因修飾系統的質量風險雖與體內基因治療產品有相似之處，但又有別于體內基因治療產品。體外基因修飾后的細胞還可能經過體外培養、換液清洗步驟，在應用于人體之前還要經過細胞終產品放行檢測。因此，基因修飾系統相較于體內基因治療產品，其修飾特性可能在回輸前得到控制， 一些相關的雜質殘留可以經過質量控制后進行放行，需要結合其特點開展體外基因修飾系統的設計和質量研究與控制。

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（一）不同研發階段的一般要求

同其他藥物的研發一樣，基因修飾系統的藥學研究也具有階段性、漸進性等特征，隨細胞終產品非臨床和不同臨床試驗階段研究的推進而變化。研發者應提前制定研究計劃和策略，鼓勵按照“質量源于設計”的理念進行相關研究，隨著研發深入，逐步優化制備工藝，加強質量控制。

臨床試驗申報階段，需識別和控制基因修飾系統的相關風險，明確其分子設計，完成生產用種子（如適用）的建庫和檢定，初步評估選用生產用原材料的合理性和安全性，通過工藝研究建立相對穩定的制備工藝，開展相應的質量研究， 建立適當的質量標準，以確保基因修飾系統及其所修飾細胞 臨床應用的安全性。

基因修飾系統應用于申報上市階段的細胞產品時，隨著對工藝和質量屬性認識的加深，工藝不斷優化，經過充分的工藝開發及驗證研究確定基因修飾系統的商業化工藝。

如果在臨床試驗期間，基因修飾系統的工藝發生變更， 需完成基因修飾系統和相應細胞產品的可比性研究；建議在確證性臨床試驗前，完成重大變更，并確定工藝。基于充分深入的質量研究和多批次數據積累，制定合理的質量控制策略，明確關鍵質量屬性（Critical Quality Atribute，CQA）， 確定適宜的分析方法，進行全面的方法學驗證；同時，應關注修飾系統相關或工藝相關的雜質研究，并制定相應的風險控制策略。規范開展并完成穩定性研究和包材相容性研究， 制定合理的貯存條件和時間。

（二）不同來源基因修飾系統的一般要求

基因修飾系統可能存在自行生產、委托生產、購買等多種來源，不同來源基因修飾系統遵循相同的技術要求和質量控制原則，藥學研究均可參考本指導原則開展。

細胞終產品的上市許可持有人應對基因修飾系統的質量負主體責任，通過加強內部質量控制或對基因修飾系統生產方的審核、制定質量協議等控制相應的質量風險。如果基因修飾系統發生變更，應及時評估風險，開展相應的藥學可比性研究，在某些情況下可能還需要非臨床或/和臨床橋接研究。

四、風險評估與控制

（一）整體風險識別與控制策略

基因修飾系統涉及的風險主要包括病毒載體回復突變、載體在基因組中整合致癌或致病、脫靶風險、外源因子污染、雜質殘留等。

藥學研究可從修飾系統的設計、制備工藝和質量控制等多個方面開展風險因素的分析，識別、確定與產品質量和安全性相關的風險因素,確定研發期間所需進行風險評估的數據范圍和重點，并制定風險防控和處理措施。同時，需結合細胞類型、劑量、給藥途徑、使用人群、作用機制、體內分布、體內作用時間等方面綜合考慮風險。

基因修飾系統設計方面，典型風險因素可能包括：風險元件的使用，同源序列可能導致的序列重組，病毒載體經相應野生型或輔助病毒互補后產生回復突變,載體在細胞中潛伏/再激活和/或動員，載體在細胞染色體整合程度和整合位點的偏好性等。制備工藝方面，相關風險因素可能包括：高風險原材料的使用，制備過程中外源因子的污染，中間產物的貯存和質量控制，有害雜質的引入與生成，以及修飾系統的基因序列穩定性等。質量控制方面，相關風險因素可能包括：檢測方法的適用性、標準限度的合理性等。

近年來，基于酶的基因編輯系統逐漸應用于細胞治療產品的基因修飾，常見的系統包括轉錄激活子樣效應因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）、規律性重復短回文序列簇-相關蛋白（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated protein，Cas）等。該類系統的臨床使用風險主要包括基因

工具酶的自身毒性、免疫原性、基因編輯時基因上靶、脫靶導致的毒性和雜質殘留等。

因此，應根據多方面因素，結合細胞終產品的特點，針 對不同類型基因修飾系統的特性進行風險評估和控制。例如， 根據風險評估情況，合理設計修飾系統的結構和序列，避免 使用致癌元件等高風險的元件，進行相關檢測，盡可能降低 同源重組和病毒載體回復突變的可能性；對高風險的生產原 材料進行質量控制，在適當的制備環節，設定過程控制的檢 測項目和驗收標準；根據修飾系統作用機理，針對基因序列 穩定性等安全性相關的風險因素開展研究等。在細胞終產品 生命周期內對修飾系統進行跟蹤分析和更新，收集數據以進 一步確定其風險特征并制定控制策略。

（二）不同生產使用情形的風險

基因修飾系統在細胞治療產品生產過程中的使用情形可能不同，目前研究可能包括體外基因修飾后直接制備細胞產品（情形一）和體外基因修飾后建系/庫再制備細胞產品（情形二）兩種使用情形。兩種使用情形相應基因修飾系統的風險不同，其藥學研究的要求可能存在差異，需要具體問題具體分析。

對于情形一，基因修飾系統建議在 GMP 的條件下制備， 該情形下所用的基因修飾系統與回輸人體的細胞直接接觸， 應關注該系統生產用原材料的質量控制、批次間的質量差異、雜質水平等可能影響細胞治療產品安全性、有效性的研究內 容。本指導原則后文主要論述該情形。

對于情形二，基因修飾系統用于細胞系/庫的建立，其 序列的設計、生產用材料、制備工藝、質量、穩定性、內包 材的要求可依具體情況，結合細胞系/庫的質量研究結果進 行綜合評估。由于基因修飾系統使用情況的復雜性（如一次 使用或多次使用），可結合生產使用情況和細胞系/庫的研究 和檢測情況，制定修飾系統的風險控制策略。良好的基因修 飾系統質量研究與控制有利于篩選、建立出質量良好的細胞 系/庫，有利于后續的生產研究。細胞系/庫建立過程中，建 議進行單克隆篩選，對細胞系/庫進行檢定和傳代穩定性研 究，關注細胞系/庫功能是否符合理論設計和預期、安全是 否可控，必要時對細胞終產品進行基因修飾相應的質量研究， 以確認基因修飾系統的適用性。

（三）變更風險

隨著基因修飾技術不斷更新和研究經驗的逐步積累，研發過程常常伴隨基因修飾系統的升級和工藝的優化，因此研發各階段基因修飾系統有可能發生變更。

基因修飾系統變更可能顯著影響細胞產品的安全性和有效性，是細胞治療產品藥學研究的重要風險之一，研發者需評估變更引入的影響和風險。根據風險評估情況，對基因修飾系統及其細胞終產品（如適用）的質量、工藝控制、穩定性等方面進行深入研究，合理設計變更可比性研究方案。

五、基因修飾系統的設計、制備和質量控制

（一）病毒載體類基因修飾系統

1. 病毒載體的設計與構建

1.1 目的基因及調控元件

目的基因是基因修飾系統中實現預期功能的關鍵序列， 調控元件是影響目的基因序列轉錄、翻譯和穩定性的重要序列。研發者應基于細胞終產品的安全性和有效性，結合風險評估，進行基因修飾系統各元件的設計與構建。

目的基因：本文中是指基因修飾系統傳遞、表達的遺傳物質，研發者應結合其在疾病治療中的作用或作用機理謹慎選用和設計目的基因序列，關注目的基因的來源、序列篩選及優化過程，明確完整的核苷酸、氨基酸（如適用）序列信息，并建議與數據庫收錄的相關序列進行序列比對。目的基因的優化中，應闡述分子改構的科學評估及驗證研究考慮，如人源化改構，敲減元件，自殺標記，以及為調控高級結構形成或為適應載體大小進行的序列改造和刪減等。同時，建議結合目的基因或其表達產物與靶分子的特異性結合能力， 評估潛在的非特異性效應等。可以結合目的基因序列特征、目的蛋白與細胞基因組的相互作用等，充分考慮目的基因對目的細胞基因組穩定性的影響。如目的基因屬于非人源或改構的序列等，也可結合種屬間目的基因序列差異和表達產物的免疫特性，評估目的基因的免疫原性。

調控元件：功能性元件對目的基因的轉錄和表達具有重 要調控作用，研發者應關注其設計原理并進行確認研究。可 以根據目的基因的表達量、預期作用和持續時間以及目的細 胞的類型等合理選擇和設計調控元件，相關的調控元件可能 包括信號肽、轉錄啟動子、增強子、終止子、隔離子、5’ 非翻譯區、3’非翻譯區、多聚腺苷酸信號區、內含子、其他 增強轉錄及翻譯效率相關元件、復制起始位點、額外引入的 基因序列等。各調控元件的序列來源及選擇依據應明確。例 如啟動子設計方面，建議結合目標細胞類型、目的基因表達 時間和表達量的需求、啟動子的人用經驗等分析其啟動子使 用的安全性，在風險評估的基礎上合理選用。調控元件設計 時需充分考慮元件的安全性和有效性，關注相關序列引入的 必要性和合理性，盡量避免使用高風險的元件，如必需使用， 應進行相關序列的安全性改構。對于序列改構或優化的元件，均應明確序列更改的依據與安全性考慮。此外，還建議關注功能元件設計對細胞基因組內源性基因的干擾。

1.2 病毒載體

病毒載體通常可以穩定、高效地轉導目的基因至目的細胞中發揮作用。病毒載體的選擇和設計可綜合考慮目的基因表達時間、表達量，病毒載體的致病性、整合能力、感染過程、轉導效率、細胞毒性以及細胞產品的細胞類型、作用機制、臨床適應癥、給藥方法等多方面。病毒載體的結構優化策略包括提高病毒穩定性、增強細胞轉導率、拓寬可轉導細胞類型等。

目前常用的病毒載體通常進行了毒力、致病性或復制能力相關基因的刪除，以確保使用的安全性。設計中，應盡可能降低與野生型病毒相關的任何致病性，并盡可能將病毒重組和回復突變的風險降到最低。對于改構的病毒載體需關注親本病毒的來源、培養歷史和生物學特性等，對改構用材料、方法、步驟及鑒定進行充分研究。病毒載體進行改構時，不應引入新的安全風險。

下面以目前研究中常見的病毒載體為例進行說明。

1.2.1 γ-逆轉錄病毒載體（γ-Retroviral Vector）

γ-逆轉錄病毒可逆轉錄其 RNA 基因組成為 DNA 拷貝， 病毒 DNA 隨機整合進入有絲分裂活躍的細胞基因組。目前， 體外基因修飾用 γ-逆轉錄病毒載體常見有鼠白血病病毒（Murine Leukaemia Viruses，MuLV），貓白血病病毒（Feline Leukaemia Virus，FeLV）和長臂猿白血病病毒（Gibbon Ape Leukaemia Virus，GALV）等載體。其基因設計與改造主要包括提高載體安全性和基因轉導有效性。

γ-逆轉錄病毒載體可通過轉移質粒（含有目的基因）、 輔助質粒瞬轉細胞進行病毒載體包裝，也可通過整合了轉移 質粒序列、輔助包裝元件的穩定產毒細胞系制備。為提升基 因修飾載體的安全性，建議對修飾系統進行優化，例如使用 刪除了非必需元件、經充分改構、安全性級別較高的 γ-逆轉錄病毒載體，盡可能將病毒重組和回復突變的風險降到最低。具體優化操作還可能包括使用異源啟動子和異源 polyA 信號表達輔助包裝元件、將輔助包裝元件拆分于不同質粒表達、改造長末端重復序列（Long terminal repeat，LTR）使得末端自失活（Self Inactivating, SIN）等方式。

基因轉導有效性方面，鼓勵研發者對病毒載體包裝元件進行優化，提高病毒載體包裝效率、結構穩定性和轉導活性等，如將 γ-逆轉錄病毒載體的包膜蛋白替換為其他包膜蛋白以提高病毒穩定性等。針對改造情況，需進行充分的研究與驗證。

1.2.2 慢病毒載體（Lentiviral Vector）

慢病毒載體通過介導目的基因整合至細胞基因組發揮作用，與 γ-逆轉錄病毒載體只能感染有絲分裂活躍的細胞不同，慢病毒載體能感染有絲分裂活躍和不活躍的細胞。目前， 體外基因修飾用慢病毒載體常見有人慢病毒、非人靈長類和非靈長類慢病毒等載體。使用非人靈長類和非靈長類慢病毒載體時建議關注產生重組病毒嵌合體和/或跨物種傳播的相關風險。慢病毒載體的設計與改造主要包括提高載體安全性和基因轉導有效性。

慢病毒載體制備和臨床使用的主要風險點包括：產生復制型慢病毒（Replication-competent lentivirus，RCL），發生體內重組，以及在相關基因中或其附近插入前病毒 DNA 從而可能引起或促進腫瘤發生和其他細胞病變等。因此，慢病毒載體設計方面，建議采用所有可能降低慢病毒致病風險的措施，包括不同包裝基因分離于不同質粒表達（如 gag/pol 和 rev 分離），降低輔助質粒和轉移質粒間的序列同源性，刪除不必要的調控元件，改造 LTR 使得末端自失活等。對于轉移質粒，鼓勵進行序列優化，提高安全性，如降低啟動子插入目的細胞引起原癌基因活化的幾率等。

為了提高基因轉導有效性，可考慮采用替換包膜蛋白、提升定點整合能力等改造策略。例如，人類免疫缺陷病毒（HIV）衍生的慢病毒載體，可通過用編碼異源病毒包膜蛋白（如 VSV-G）的基因替換 HIV 包膜蛋白基因序列來制備以增強載體的親嗜性和穩定性。通過對整合酶和 LTR 等序列進行改造，提升慢病毒載體的定點整合性能。對載體改造的同時，建議關注病毒載體穩定性的變化、整合位點的偏好性等可能引入的風險。

1.2.3 仙臺病毒載體（Sendai Viral Vector）

仙臺病毒載體是在細胞質表達目的基因，通常不整合于細胞基因組中的單鏈反義 RNA 病毒載體。目前有研究將其應用于細胞重編程建立誘導多能干細胞系（iPSC）的過程中。設計和構建時，在穩定表達目的基因的同時，為防止產生具有復制能力的病毒顆粒，可考慮刪除或改構病毒組裝相關蛋白，例如參與病毒組裝的核衣殼結構蛋白以及基質蛋白等。為確保有效地控制 iPSC 中仙臺病毒載體的殘留量，可以考慮改構復制相關元件，例如通過 RNA 聚合酶的突變等方式， 構建具有溫度依賴型復制能力的仙臺病毒載體；同時，需建立相關方法檢測和驗證仙臺病毒載體在 iPSC 克隆中是否殘留以控制風險。

其他病毒載體還可能包括腺病毒、腺相關病毒等載體， 其分子設計和構建可以結合特定病毒結構、目的基因序列特征、包裝序列的安全性等綜合考慮。基本原則可參考上述內容。

2. 生產用物料

2.1 質粒

對于采用多個質粒瞬時共轉染方式制備的病毒載體，需根據風險、結合載體特性等，開展相應的質粒設計構建、生產工藝、質量控制和穩定性等研究。

設計和構建：根據研究，選擇合理的質粒骨架、質粒復制起始點、啟動子以及選擇性標記等組成元件，刪除非必需元件（特別是致癌等風險較高的序列），并完整確認質粒的核苷酸序列。質粒構建時一般應避免使用 β-內酰胺類抗生素抗性基因，且質粒設計時建議最大程度防止抗性基因序列插入病毒載體基因組中，鼓勵開發研究采用非抗性基因篩選的質粒。采用額外的增強轉錄或翻譯的元件時，應充分評估其功能性和安全性，在必要時，進行相應的安全性改造，如土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件（Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element, WPRE）等。建議盡可能將不同包裝元件拆分于多個質粒進行表達，以降低同源重組發生的概率。

生產工藝：根據工藝研究情況，通過對關鍵工藝參數的探索和優化，確定穩定的質粒規模化生產工藝，生產工藝應有明確的生產規模、工藝流程、工藝步驟的詳細描述以及過程控制策略等。質粒生產過程中應盡量避免使用人源和動物源性材料，避免使用 β-內酰胺類抗生素，如需使用其他種類的抗生素，應對抗生素的殘留量進行控制和安全性評估。基于研發階段和風險評估，開展質粒工藝驗證或確認研究，如工藝過程控制確認、中間產物貯存穩定性研究、多批次質量分析以及雜質清除研究等。

質量控制：需建立合理的質量標準并進行放行檢驗。質粒放行的質控項目一般包括：pH 值、外觀、鑒別（限制性內切酶分析和測序）、質粒濃度 / 含量、純度與雜質（A260/A280、超螺旋比例、宿主菌 DNA 殘留、宿主菌 RNA 殘留、宿主蛋白殘留、抗生素殘留（如適用））、無菌及細菌內毒素等。

穩定性研究：選擇合理、敏感的考察項目（如超螺旋比例等）進行穩定性監測，根據研究結果制定合理的貯存條件和有效期。

2.2 細菌種子批

本指導原則細菌種子批指通過將病毒包裝質粒轉化宿主菌，經單克隆篩選及培養傳代后建立的種子庫。對于選用的宿主菌，需充分考慮宿主菌的來源、基因型、表型、既往使用經驗和生產需求等因素，如使用新型菌株，需關注其可能引入的額外風險。

細菌種子批的建立：根據研究建立各級細菌種子批，明確制備規模、擴增條件、貯存條件等。研究中關注目標克隆篩選的情況，關注用于生成種子批的材料的來源、生產過程等以評估分析安全性風險。

細菌種子批的質量控制：建立適宜的放行檢測項目、標準和檢測方法。檢測項目一般包括細菌形態學鑒別、染色鏡檢、生化特性分析、抗性檢查、質粒限制酶切圖譜分析、目的基因和其他元件序列準確性分析等。檢測方法需經過研究確認和/或驗證。通過質量控制應確保不存在其它細菌、真菌和噬菌體的污染，以及確保目的基因序列和其他元件序列的準確性。

細菌種子批穩定性研究：傳代穩定性一般包括質粒大小、質粒序列準確性、質粒限制酶切圖譜、質粒保有率、質粒拷 貝數等，根據研究結果明確種子批的限定傳代代次。貯存穩 定性建議關注在貯存條件下和時長內種子批的活率等。

2.3 生產/包裝細胞庫

病毒載體制備涉及的細胞基質包括包裝病毒載體用細胞基質和可以穩定產生病毒載體的細胞基質。選擇細胞基質時，需要考慮病毒載體包裝和制備的可行性，結合細胞來源（包括物種來源）、生長特性和載體制備能力，以及可能影 響最終產品安全性的細胞特征等，選擇適合的細胞基質。風 險評估時，要充分考慮細胞基質中是否存在內源性病毒顆粒、致癌序列等。對于新建立的細胞基質或具有相應風險的細胞基質（如腫瘤細胞來源的細胞），適用的情況下應評估細胞 的成瘤性和致瘤性。有些情況下，需要對細胞基質進行修飾（例如插入特定病毒蛋白表達序列允許病毒復制或包裝），研究中應該關注修飾后細胞的遺傳、表觀和生長等特性以及病毒載體制備情況等。細胞基質選定和/或修飾后需建立細胞庫，以確保生產的穩定性和一致性。可參照《中國藥典》、ICH Q5A、ICH Q5D 等相關要求對細胞庫進行檢定。檢測項目需根據風險評估確定，至少包括鑒別、無菌、支原體、螺原體（昆蟲細胞）以及內、外源病毒因子、種屬特異性病毒等。開展細胞庫傳代穩定性研究，包括細胞生長穩定性、遺傳穩定性、病毒載體包裝能力穩定性等，建議研究中納入病毒載體的生產終末細胞或平行生產的對照細胞，擬定適合病毒載體制備的細胞限傳代次。

包裝病毒載體用細胞庫：細胞庫細胞經擴增、質粒轉染后合成病毒載體基因序列、表達載體蛋白，并最終形成病毒載體顆粒。例如，目前慢病毒載體包裝常見使用 HEK293T 細胞，轉入該細胞的質粒 LTR 之間的 DNA 片段被轉錄成RNA，由輔助質粒表達的蛋白將其包裝形成病毒載體顆粒。需要關注的是，當病毒載體與非載體 DNA 序列（如質粒DNA、輔助病毒序列、細胞 DNA 等）共同包裝時，非載體DNA 序列可能與病毒載體同源重組，或其殘留可能產生致癌風險，建議開展風險分析與研究，評估細胞基質選用的合理性。例如使用含有腺病毒 E1、SV40LT 抗原等風險元件的細胞基質包裝慢病毒載體時，應關注載體中腺病毒 E1 和SV40LT 抗原序列的殘留量。

可以穩定產生病毒載體的細胞庫：細胞基質經基因修飾、篩選、建庫后可穩定表達或產生病毒包裝用蛋白或元件，完 成病毒包裝和制備。例如，γ-逆轉錄病毒載體制備常見使用小鼠 PG13、HEK293-Phoenix 細胞等，生產用細胞需穩定表達 gag-pol、包膜蛋白、目的基因等。構建過程中建議關注其病毒包裝效率和所產病毒載體的質量，并降低內、外源因子污染和復制型病毒產生等安全性風險。穩定產毒細胞系需經過基因修飾并通過單克隆篩選獲得，獲得的單克隆細胞系需建立細胞庫，并進行全面的檢定。同時，開展細胞傳代穩定性研究，關注不同代次穩定產毒細胞中插入基因片段的遺傳穩定性以及病毒載體的產量和質量等。

2.4 病毒種子批

通過病毒種子制備病毒載體或者輔助病毒的，需建立病毒種子批。病毒種子的來源、歷史培養情況等需清晰明確， 且風險可控。對于培養歷史不清晰，存在其他病毒污染風險， 或毒株單克隆性無法確認的病毒種子，不建議使用，如確需使用，可以在構建過程中進行多輪噬斑純化、有限稀釋純化或通過 DNA/RNA 克隆拯救等，以確保毒株的純度和單克隆性。

種子批的建立過程、代次、貯存和維護等信息應清晰、明確；如有，應說明種子批制備過程使用的人源/動物源材料，并進行安全性評估。

病毒種子批應經過充分檢測，檢測項目建議包括：無菌、支原體以及外源病毒因子、病毒載體和目的基因的鑒別與測序、病毒滴度或濃度、生物學活性、雜質、對抗病毒藥物的敏感性（如適用）、回復突變（如適用）等。建議對病毒種子批進行全基因測序，并對測序結果與預期序列進行對比分析，如有，需對所有差異進行評估。對于序列較長的病毒載體，建議最大程度進行序列分析，所分析的序列建議包括基因插入片段、側翼區域以及載體中被修飾或可能易于重組的區域。

病毒種子批需開展全面的傳代穩定性研究，研究過程應能代表或模擬實際制備工藝，研究中關注病毒種子批的遺傳穩定性和生產穩定性等。根據研究，制定病毒種子批的限定傳代代次。

如病毒載體制備過程使用了輔助病毒，應開展充分的研究說明輔助病毒使用的必要性和選擇依據，結合科學認知及生產經驗說明輔助病毒的安全性。輔助病毒的設計構建、建庫、生產制備和檢定建議參考上述病毒種子批的一般要求。

2.5 其他生產用物料

其他生產用物料包括原材料（如試劑、培養基等）、耗材、培養容器等。結合工藝研究，選用適宜的生產用原材料， 制定合理的原材料質量控制標準，進行嚴格的供應商審計， 明確生產用原材料的來源、組分、功能、使用階段、質量標準等。制備過程中盡量避免使用人或動物來源的成分，如果確需使用，可參考《中國藥典》相關規定和/或 ICH Q5A 等指南開展外源因子等安全性相關的風險評估與研究。需要重點關注的原材料包括：用于細胞培養的人或動物源材料（如牛血清、消化酶），質粒轉染試劑（如聚乙烯亞胺、陽離子脂質等），核酸酶等。對于病毒載體制備或貯存時使用的人血白蛋白等風險較高的制品，建議盡可能選用經監管部門批準，并符合國家相關技術要求和管理規范的產品。對于耗材和培養容器，建議經過分析和研究，評估其適用性，盡量降低病毒載體制備過程中的安全性風險。

3. 制備工藝

病毒載體的制備工藝是指從生產用細胞的復蘇擴增、病毒載體的收獲到病毒載體灌裝、貯存（如有）的全過程。對于體外基因修飾后直接制備細胞產品的病毒載體系統，由于病毒載體質量可直接影響終產品質量，因此其制備工藝研究應更加充分完善。在對整體工藝的充分理解和對病毒載體質量的累積經驗基礎上制定制備工藝，建立規范的工藝操作步驟、工藝控制參數和廢棄標準，并明確關鍵工藝參數。制備工藝應適用于確保細胞產品符合對應開發階段的質量目標產品概況的要求。另外，還應采取措施避免病毒載體在制備、貯存、運輸的整個過程中發生混淆、污染與交叉污染等。

3.1 制備規模和批次定義

不同類型病毒載體的生產用細胞類型、生長特性、病毒載體產量和穩定性等存在較大差異，制備工藝成熟程度及病毒載體使用量等也不盡相同，建議結合待基因修飾細胞的特性、病毒載體的工藝和臨床使用需求等，合理確定病毒載體的制備規模。病毒載體制備規模需與細胞終產品研究階段（臨床試驗、商業化制備）相適應。工藝中可能包括生產用細胞培養、質粒轉染或病毒感染、收獲、純化等步驟，制備過程中的上、下游工藝規模需盡量匹配且合理。對于較小的規模，建議關注不同批次間的質量一致性。

根據病毒載體工藝特點，制定批次定義和編號規則。如有需要，可明確制備過程中不同工藝步驟，特別關注如有分批和合批的操作步驟時的批次定義和編號規則。確保病毒載體批次的可追溯性。

3.2 工藝研究與開發

用于制備病毒載體的工藝有多種，包括通過質粒 DNA 瞬時轉染包裝細胞基質制備，通過穩定的生產用細胞系制備， 或通過病毒種子感染細胞基質制備。

鼓勵結合質量源于設計和全過程控制等新理念，以及對 相關風險控制的一般要求開展工藝研究。隨著生產經驗的積 累和質量屬性認識的加深，不斷優化工藝，最終完成實驗室 工藝到商業化規模工藝的轉化。制備工藝一般可以分為上游、下游兩個階段，即上游病毒載體收獲階段和下游病毒載體純 化階段。制備過程中的生產用細胞種類、細胞培養條件、轉 染或感染條件、收獲時間、純化步驟及貯存條件等均會影響 病毒載體的包裝效率和質量。研究中需對工藝步驟、關鍵工藝參數及其控制范圍進行研究、確認或驗證，并建立相應的過程控制標準。例如，復制型病毒（Replication competent virus, RCV）是過程控制中的安全性風險關注點之一，應根據病毒載體種類、工藝特點等開展風險評估，在制備過程中選擇合理的檢測點（如病毒載體收獲液、生產終末期細胞或純化后的病毒載體原液等），采用經驗證的方法開展檢測。另外，基于風險，結合病毒對于理化條件的耐受性，必要時， 還需根據生產用細胞類型、輔助病毒使用、純化工藝特點等建立相應的病毒去除/滅活步驟并進行充分的驗證。

下文以 γ-逆轉錄病毒載體和慢病毒載體為例分別對穩定產毒和質粒轉染兩種制備工藝進行介紹。其他病毒載體和其他制備方式，如適用，也可參考。

3.2.1 穩定產毒制備工藝研究

（1）制備

以 γ-逆轉錄病毒載體為例，制備時其由穩定產毒細胞分 泌至培養液中，可經過澄清過濾等步驟純化獲得病毒載體。建議根據病毒載體的結構特性、包裝機制、穩定性等制定合 理的工藝步驟和參數，關注制備過程中的細胞培養體積、接 種密度、培養條件、收獲時間等。例如，有報道稱由于 γ- 逆轉錄病毒載體的一些包膜蛋白在通常細胞培養條件（37℃） 下的穩定性較弱，針對該情況建議開展研究，制定相應的病 毒制備和收獲策略，以確保病毒載體的活性和回收率。

（2）純化

根據 γ-逆轉錄病毒載體的結構特點、宿主細胞的種類、雜質殘留的成分等,設計合理的純化工藝，以提高病毒載體的純度，降低雜質殘留的安全性風險。

例如，某些病毒載體的包膜蛋白可能對層析工藝比較敏感（如剪切力），因此，鼓勵開發先進的純化工藝，在滿足病毒載體結構穩定性和功能活性的基礎上，盡可能提高病毒載體的純度，實現病毒載體的規模化純化。

3.2.2 質粒轉染制備工藝研究

（1）包裝與制備

以慢病毒載體為例，用于質粒轉染的病毒包裝細胞通常 采用貼壁或懸浮方式培養，細胞培養方式建議根據規模、制 備工藝設計和質量研究等選擇以滿足商業化制備的需求。病 毒包裝工藝的研究包括對質粒濃度、質粒比例、轉染試劑及 濃度、誘導試劑濃度（如有）、轉染時間、細胞密度、細胞 培養基組分、細胞培養環境（溫度、pH、溶氧）、收獲時間、 收獲次數等參數的優化。根據研究，確認工藝步驟、關鍵工 藝參數及其控制范圍，并建立相應的過程控制標準。例如在 細胞培養過程中定期檢測細胞活率和生物負荷，開展載體滴 度、支原體和外源性病毒等檢測，并進行復制型慢病毒（RCL） 檢測等。載體收獲液如需貯存，需開展相應的研究以確認貯 存條件、貯存方式等。對于外源因子檢測，建議盡量提高檢測方法的靈敏度，在適宜的檢測點（如外源因子富集的階段） 進行檢測。

（2）純化

目前，慢病毒載體的純化工藝通常采用核酸內切酶去除附在病毒載體表面的大片段核酸雜質，經澄清、過濾及離子層析或分子排阻色譜等純化步驟進行雜質的去除，最后經制劑、除菌過濾、灌裝制成病毒載體以備使用。根據研究，純化工藝可以進行適當的調整和優化，研究確定各純化工藝步驟以達到去除雜質，純化病毒的目的。如適用，工藝研究中建議對核酸酶濃度、純化方式、介質選擇、動態載量、流速、回收率、病毒載體貯存條件、灌裝工藝參數等進行研究，并對核酸酶殘留、BSA 殘留、風險元件殘留（如腺病毒 E1 和SV40LT 抗原序列殘留）、質粒 DNA 殘留、宿主蛋白殘留、宿主 DNA 殘留及轉染試劑殘留等雜質的去除率進行研究。純化工藝過程中需加強過程控制檢測或質量研究，如生物負荷、內毒素、物理滴度、轉導滴度等。

3.3 工藝驗證

制備工藝鎖定后需開展工藝驗證以對各步驟的工藝進行確認，如適用，可以包括細胞擴增和載體制備各個步驟的驗證、中間產物貯存條件和時間驗證、雜質清除驗證、培養基模擬灌裝驗證、層析柱和超濾膜循環使用次數和除菌濾器的驗證以及運輸驗證等。通過工藝驗證證明制備工藝及其在設定的工藝參數范圍內可持續、穩定的開展生產，病毒載體 的產量和回收率應相對穩定，對殘留的核酸酶、宿主細胞蛋 白、宿主細胞 DNA、質粒 DNA、細胞碎片、轉染試劑等雜質，應有效清除至低于質量標準范圍或經過驗證研究的水平。

鼓勵建立上、下游規模匹配的制備工藝，如果在制備過程中出現合批和/或分批的情況，需結合實際制備情況進行充分的研究驗證，根據研究結果制定合批和/或分批的原則及具體操作規范。用于合批的樣品在合批前應經過檢驗確認為合格樣品。

4. 質量研究與質量標準

4.1 質量研究

鼓勵運用先進的分析方法，多角度、多層面地開展質量研究。分析方法需經過研究和確認，確保結果的準確、可靠。一般建議采用多個代表性批次開展質量研究，常見的研究項目包括外觀、病毒載體形態、鑒別、整合特征（如適用）、病毒載體滴度、生物學活性、純度、雜質（如復制型病毒、風險元件殘留、外源因子）等。根據研究結果，確定關鍵質量屬性。

4.1.1 鑒別與序列確認

可從病毒載體的整體水平、蛋白水平和核酸水平進行檢測。整體水平方面，可采用電子顯微鏡觀察、免疫血清學等方法分析鑒別。蛋白水平方面，可采用蛋白質電泳、免疫印跡等分析方法對載體的結構蛋白、表達產物、蛋白表達譜、免疫標記、表型特征等開展分析。核酸水平方面，建議對病毒載體進行全基因組測序以確認序列。需特別關注目的基因及調控元件序列的完整分析，對比分析測定序列與預期序列的一致性。對于整合型病毒載體，也可將病毒載體轉導目的細胞后，對整合有載體序列的細胞基因組進行測序，驗證載體骨架及目的基因序列的準確性。另外，還可采用限制性酶切圖譜分析、聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction， PCR）等方法對病毒載體和目的基因進行鑒別。鑒別試驗應設置合適的陽性和陰性對照。

4.1.2 整合特征

對于整合型病毒載體，建議選用適用的方法，研究載體整合至目的細胞基因組的典型特征，包括優勢插入位點、插入拷貝數、優勢克隆異常生長等。關注是否存在病毒載體優先整合至目的細胞基因組癌基因附近的情況及其他潛在的致癌風險。

4.1.3 病毒載體滴度

滴度是病毒載體生物學活性和含量的重要檢測項目，可用于工藝過程監控和放行檢測，需選擇靈敏度、準確度、精密度等符合要求的檢測方法開展研究。鼓勵采用多種方法進行滴度的檢測，并探索不同方法檢測數值的相關性。滴度檢測包括物理滴度（病毒載體總顆粒數）和轉導滴度（病毒載體感染性顆粒數）。研究中需使用標準品或對照品來校準滴度檢測結果。可以通過病毒載體中感染性顆粒與總顆粒的比例，用于比較不同批次之間和載體制備的不同階段之間的質量特征。

物理滴度：載體特定蛋白/核酸的定量可用于載體顆粒數量（物理滴度）的估計。例如，HIV-1 衍生的慢病毒載體， 常用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測載體樣本中的 p24 蛋白從而進行物理滴度的檢測，檢測結果可以 p24 蛋白含量/ml 或顆粒數/ml 表示，檢測時應關注游離 p24 蛋白對結果的影響。此外，載體基因組拷貝數的定量也可用于物理滴度的估計，檢測時建議關注外源 DNA 的干擾。若采用新技術檢測，如病毒計數儀法、納米顆粒跟蹤分析法、場流分離- 多角度激光光散射法等，建議關注方法對待測病毒載體類型的適用性。

轉導滴度：可使用基于細胞的體外檢測方法檢測病毒載體的感染能力。通常待測病毒載體感染細胞一定時間后，通過細胞基因組定量 PCR、流式細胞術、組織/細胞病變或形成噬斑等方法檢測，計算出病毒載體的轉導滴度，檢測結果通常以轉導單位（TU/ml）、半數組織培養感染劑量（TCID50）或噬斑形成單位（PFU）等表示。

4.1.4 生物學活性

一般指將目的基因轉移到目的細胞的能力以及目的基因表達產物的生物學效應，其中基因轉移能力也與病毒載體的轉導滴度相關。生物學活性研究貫穿在整體研究開發過程中，建議在研發早期建立生物學活性檢測方法；上市階段， 建議根據載體的作用機制和質量屬性，盡可能確定與實現預期功能（替代、補償、阻斷、修正特定基因作用等）相關的生物學活性檢測方法，必要時，建立合適的標準品。由于病毒載體的生物學活性發揮可能在細胞終產品中體現，因此， 也可以結合終產品的生物學活性綜合評價病毒載體的生物學活性。

4.1.5 純度和雜質

（1） 載體相關雜質：與病毒載體相關的典型雜質可能包括錯誤包裝顆粒、缺陷干擾顆粒、非感染性顆粒、空衣殼顆粒、聚集體或復制型病毒等，建議采用適用的方法，例如高效液相色譜、電泳法、毛細管電泳法、紫外吸收光譜法等進行研究。通過病毒載體中總顆粒與感染性顆粒的比例，也可以反映病毒載體的純度和雜質情況。另外，在核酸水平， 可以考慮鑒定具有缺失、重排、雜交或突變序列的載體等相關雜質，以含量比率的形式報告檢測數值，必要時應納入質量標準。

（2） 復制型病毒的檢測：采用復制缺陷型或條件復制型病毒載體時，需在工藝的適當階段檢測制備過程中可能產生的具有復制能力的病毒，并根據細胞終產品給藥劑量、病毒載體風險等確定殘留量的標準限度。復制型病毒與產品的 安全性相關，需參考相關研究經驗或文獻，研究并建立靈敏 的檢測方法。常見的檢測方法包括指示細胞培養法、直接qPCR 法等。待測樣品包括病毒載體制備過程中收獲的病毒載體收獲液、生產終末細胞和細胞終產品等。方法開發時， 需關注各檢測方法對應的操作流程、樣本量、陰性對照、陽 性對照、檢測標志物、檢測限、判定標準等方面的設定和驗 證研究。建議根據所用病毒包裝系統設計特異的檢測標志物， 如適用，研究中鼓勵同時采取兩種以上基于不同原理或針對 不同標志物的檢測方法，從而提高復制型病毒的檢出率。當 采用指示細胞培養法時，需選擇合理的擴增細胞和指示細胞， 并應考慮待檢樣本對指示細胞生長的抑制作用等，研究、設 置合理的待測樣本滴度范圍，并建議設置干擾組對照。

復制型逆轉錄病毒（RCR）檢測：根據目前的研究技術水平，建議采用敏感的指示細胞培養法對γ-逆轉錄病毒載體進行 RCR 檢測。RCR 擴增細胞與待測樣本進行共培養以最大程度擴增 RCR，在一定傳代次數和時間的傳代培養后取適量上清接種 RCR 指示細胞培養，以觀察、計數細胞病變集落或者進行 RCR 標志物的檢測。

復制型慢病毒（RCL）檢測：根據目前的研究技術水平，建議采用指示細胞培養法對慢病毒載體進行 RCL 檢測。對于 HIV 衍生的慢病毒載體，其 RCL 檢測所用陽性對照可考慮使用滿足檢測要求的 HIV 病毒，如缺乏輔助基因的，同時具有復制能力的病毒，研究并評估陽性對照病毒的結構和制備方法，并在符合要求的環境中妥善操作和使用。RCL 檢測指標方面，通常認為 p24 蛋白、逆轉錄酶活性、psi-gag 和 VSV-G 序列等的檢出可反映 RCL 的存在，結合病毒載體具體情況和研究情況，選擇合適的檢測指標。

（3） 工藝相關雜質：可能包括殘留宿主細胞蛋白、非目的核酸序列、輔助病毒污染物（如傳染性病毒、病毒 DNA、病毒蛋白等）和工藝中所使用的試劑殘留，例如細胞因子、生長因子、抗體、轉染試劑、磁珠、核酸酶、血清和溶劑等。

以非目的 DNA 殘留為例，其可能包括與病毒載體共純化的殘留宿主 DNA、質粒 DNA 等，是常見的工藝相關雜質。包裝過程中病毒載體的衣殼內部也可能共包裝非目的 DNA， 這些雜質可能對產品質量和安全性產生不利影響，建議優化 工藝，以減少其污染。必要時，對殘留的非目的 DNA 序列進行確認和含量的監測。當生產/包裝細胞為腫瘤來源的細 胞、致瘤細胞系或攜帶有致癌基因序列等需要高度關注的細 胞時，在優化工藝、降低其殘留的基礎上，還建議控制非目的 DNA 片段大小（建議在 200bp 以下），并對已知的高風 險基因進行專項監測。例如，采用HEK293T 細胞進行慢病毒載體制備時，需采用具有足夠的靈敏度和特異性的方法檢 測腺病毒 E1 和 SV40LT 抗原序列的殘留。

4.1.6 其他

微生物污染物：檢測可能引入的污染物，包括外源病毒、細菌、真菌、支原體、細菌內毒素等。

理化檢測：常規的理化檢測項目可能包括外觀（顏色、透明度）、可見異物、不溶性微粒、pH、含量、滲透壓等。

4.2 質量標準

質量標準是質量控制的重要部分，包括檢測項目、檢測用方法學和各檢測指標的可接受標準。檢測階段一般包括放行檢測和/或過程控制等。

根據現有研究認知，病毒載體的質量標準檢測項目通常包括外觀、鑒別、純度、含量/滴度、生物學活性、雜質、無菌性、細菌內毒素、支原體和外源病毒因子等。檢測用方法需經過研究與驗證以確保檢測結果可靠和準確。如適用， 盡量建立對照品/標準品，并對其開展相應的質量研究、含量/活性的標定、確定貯存條件等。一般情況下，可接受標準的制定依據包括產品質量設計、質量研究、工藝開發、驗證研究、方法學研究與驗證、多批檢測和穩定性結果，以及合理的統計學方法等。

（二）非病毒載體類基因修飾系統

非病毒載體類基因修飾系統可通過物理、化學或生物轉導方式遞送進入細胞。進入目的細胞后，通過轉錄、剪切、翻譯等方式發揮作用，其活性組分為DNA、RNA 或蛋白質，也可能為核酸與蛋白質組分的組合。

1. 分子設計

非病毒載體類基因修飾系統的設計影響目的基因修飾或目的基因表達的特異性、準確性和有效性，也影響基因修飾細胞終產品的安全性和有效性，構建時需要對設計和改構的利弊進行權衡分析。

對于 DNA 類基因修飾系統，開發過程中需關注基因轉導效率、脫靶效率、插入突變情況、目的基因在目的細胞中的整合位點及拷貝數等。采用的設計策略包括基因密碼子優化、染色體同源序列的改構、富含 GC 區序列的改構、信號肽以及合理啟動子的應用等。目前體外基因修飾常用的環狀DNA 類基因修飾系統，包括質粒、微環（Minicircle）DNA、納米質粒（Nanoplasmid）等不同類型。不同類型環狀 DNA 的選擇可重點關注高純度載體制備的難易程度、載體重組、細菌來源 DNA 序列在目標細胞內的表觀遺傳修飾對目的基因表達的影響等。此外，環狀 DNA 類基因修飾系統內可引入特殊的 DNA 片段，形成游離型載體，如引入 EBV 來源的順式作用 DNA 片段OriP 和反式作用的EBNA1 基因的載體，此類載體需關注種屬、細胞類型對游離型載體功能的影響，載體重組、順式/反式作用 DNA 片段對目的基因表達的影響等。

對于 RNA 類基因修飾系統，以 mRNA 為例，根據目前的研究進展，考慮到設計對 RNA 的穩定性和其在目的細胞內的生物學活性等可能具有顯著影響，構建時可以關注堿基修飾類型和比例、5’-帽或帽類似物結構、非翻譯區序列、Poly（A）加尾結構和自擴增元件（如有）等，并同時進行密碼子優化、調控堿基間作用力及高級結構等方面的改造， 以實現預期的功能。

對于基因編輯系統，建議對靶向序列、目的基因序列（如有）和基因編輯用酶等的序列和比例等進行優化。通過特定細胞中的基因編輯效果確認基因編輯用酶和靶向序列的特異性，篩選最佳的靶向結合序列（如 sgRNA 序列），并采取措施降低基因脫靶、插入突變的概率及對目的細胞基因組穩定性的不良影響。對于轉座子系統，建議考慮整合位點的特異性和分布趨勢， 以及轉座子在基因組中的移動 （genomicmobilization）等特征，進行轉座子序列、轉座酶及相應調控元件的優化，合理設置轉座序列/轉座酶的比例、序列分布等。

2. 生產用物料

基本原則可參考病毒載體類基因修飾系統部分的相關要求。

對于采用重組技術或生物/化學合成技術制備的生產用原材料，需明確工藝和質量控制情況，特別是需要分析生產過程中可能引入的安全性相關雜質。對于制備過程中使用的酶類試劑，建議重點關注酶的功能活性，例如需關注所用DNA 聚合酶、RNA 聚合酶的保真度和活性，消化酶的酶解作用、酶的非特異性消化條件等，同時需要關注酶的純度、生產過程中引入的雜質等。對于核苷酸、5’-帽或帽類似物等原材料，其整體的質量應符合制備的要求，建議關注鑒別、濃度、純度和雜質等。制備過程建議避免使用氯化銫、溴化乙錠、氯仿等毒性物質，避免使用動物源胰蛋白胨、核酸酶等可能引入外源因子等風險的原材料。

對于用作遞送系統的材料，其制備涉及的關鍵原材料（脂質、陽離子聚合物等）需進行充分的篩選和質量控制。

3. 制備工藝

基本要求同病毒載體類基因修飾系統。對于體外基因修飾后直接制備細胞產品的情況，需要多次、規模化的制備， 具體情況介紹如下。

3.1 DNA 類基因修飾系統

以質粒 DNA 為例，其制備步驟一般包括微生物培養及發酵、菌體收集、菌體裂解、質粒純化、濃縮、灌裝等。工藝研究與確定過程需對關鍵工藝參數進行探索和優化，建立穩定的制備工藝。關鍵工藝參數可能包括發酵培養基組成、發酵培養溫度、補料培養基組成、補料時間和補料量、溶氧量、堿裂解緩沖液及中和緩沖液的組成、堿裂解時間、層析柱載量、層析流速等。研究中建議關注制備全過程對質粒結構和功能可能的影響，如堿裂解步驟可能產生的質粒不可逆變性的情況等。純化工藝開發過程中，可以根據質粒的實際大小和性質選擇合適的柱層析填料，最大程度去除宿主RNA、宿主 DNA、DNA 碎片和細菌內毒素等雜質。根據研究，設置合理的過程控制指標和可接受標準，如質粒中間產物的濃度、超螺旋比例、雜質殘留量等。

3.2 RNA 類基因修飾系統

基于研究現狀，RNA 的制備一般包括體外化學合成和DNA 轉錄兩種工藝路線。體外化學合成工藝請參考化學藥物的相關技術指南。DNA 轉錄工藝路線以 mRNA 的制備工藝為例，該工藝一般采用 DNA 轉錄模板進行 mRNA 體外轉錄、mRNA 加帽、去磷酸化、DNA 酶處理、mRNA 純化等步驟。建議對工藝參數進行研究與優化，開發穩健的工藝， 確保 mRNA 序列正確性、結構完整性、生物學活性和不同批次間質量的一致性。對工藝中引入的潛在雜質進行研究， 明確雜質的來源、去除步驟和去除能力等。工藝研究中需對關鍵工藝參數及控制范圍進行確認，如 NTP 濃度、轉錄時間、反應溫度、加帽反應物料投料比、層析介質、動態載量等，關注產品回收率、雜質去除率、加帽率、poly（A）長度及分布（如適用）、mRNA 片段的完整性以及序列的準確性等方面。制備過程中需設置合理的過程控制指標，如mRNA 濃度、雙鏈 mRNA 含量、不完整 mRNA 含量、殘留DNA、無菌、細菌內毒素等。

3.3 其他

基因修飾系統如含有重組蛋白質成分，根據具體情況， 可以參考重組蛋白質類生物制品生產的相關技術要求。

4. 質量研究與質量標準

4.1 質量研究

質量研究通常包括鑒別、結構特征、理化特性、生物學活性、純度和雜質分析等。研究中建議采用多個代表性批次開展研究。如含有化學合成的組分和/或重組蛋白組分的， 可參考相關指導原則等開展質量研究。

鑒別和序列確認：鑒別研究中，可采用限制性內切酶進行酶切，對酶切產物進行電泳分析，觀察是否存在特征性的帶型；也可以用 PCR 方法進行擴增，分析片段大小是否與理論大小一致等方法。對于 RNA，可將其逆轉錄為 DNA 后，采用上述方法進行鑒別，或考慮采用其他適用的方法。序列確認研究中，建議開展全序列測定，重點關注目的基因和調控元件的序列正確性，對于 RNA, 如有，建議同時關注 poly（A）序列的正確性。

結構：建議采用適用的方法對結構完整性和大小均一性進行研究。如對于 DNA，可關注其是否存在單鏈、雙鏈、線性/開環、環狀和超螺旋等多種結構形式，以及可能的高級結構等；對于 mRNA，可關注其不同區域結構的完整性（如 5’-帽或帽類似物結構、poly（A）長度）、堿基修飾結構、去磷酸化程度以及可能的高級結構（如莖環結構）等。若功能活性與高級結構相關，建議分析研究高級結構特征。對于復合核酸類基因修飾系統，建議開展結構分析，如關注復合結構的粒徑大小、粒度分布、顆粒聚集等。

理化特性：建議開展分子量、核酸濃度/含量、修飾位點及比例（如有）、物理特性（如 pH、滲透壓）等方面的研究。

生物學活性：根據作用機制，生物學活性研究通常包括對基因修飾效率、目的基因表達的水平、表達產物的功能或體外模擬生理功能的測定等。建議首選定量檢測方法，如可通過目的基因或基因編輯產物的表達量和功能進行分析，關注表達產物是否與預計一致或蛋白表達/基因是否被抑制、空間結構是否符合設計（如多聚體）等。當采用體外轉染檢測細胞的方法時，需關注選擇的檢測細胞是否具有代表性和合理性。

純度：可以采用瓊脂糖凝膠電泳、高效液相色譜、毛細管電泳等方法開展純度的研究。對于復合核酸類基因修飾系統，建議關注包封率、游離核酸含量等。

雜質：一方面，雜質可能來自原材料、制備過程、制備 和貯存過程中直接接觸容器和材料的溶解物。如 DNA 模板、酶類試劑、磁珠等原材料和添加的成分；乙醇、異丙醇等有機溶劑；宿主蛋白殘留、宿主 DNA 殘留、宿主 RNA 殘留等。另一方面，與基因修飾系統相關的雜質，可能包括缺失、重排、雜交或突變序列等相關雜質，建議進行定性和定量的相關研究。對于 DNA 類基因修飾系統，相關研究可以包括開環/線性 DNA 含量、過度甲基化修飾的分子等。對于mRNA 類基因修飾系統，相關研究可以包括降解/斷裂產生的 RNA 片段、加帽不完全的 mRNA、修飾過度的 RNA、RNA 錯配序列、RNA 氧化產物等。結合制備工藝的雜質清除能力，采用適用的方法對雜質的殘留水平進行分析，評估相關安全性風險。

微生物安全性：可結合工藝過程，檢測可能引入的污染物，包括細菌、真菌、支原體（如適用）、細菌內毒素等。

其他特性研究：對于使用基因編輯工具酶的修飾系統， 質量研究中建議持續關注對應細胞產品中修飾系統的殘留 情況，采用生物信息學工具分析靶細胞基因組結構變化、單點和小規模基因突變以及外源DNA 在基因組中的插入位置、拷貝數等，監控基因編輯用酶的細胞內持續表達時間，考察脫靶效應及相應的安全性影響等。

4.2 質量標準

根據風險分析，結合工藝研究與驗證、臨床試驗及商業化批次質量分析、穩定性研究數據等制定合理的質量標準， 明確各檢測項對應的分析方法、標準限度范圍并建立標準品/參考品等。對于一般工藝相關雜質，如經充分驗證證明工藝可對其有效、穩定地清除，可結合工藝進行控制，相關殘留檢測可考慮不列于檢定項目中。

質量控制項目可以包括理化性質、純度和雜質、生物學活性、微生物安全性等。其中，DNA 類的質量標準可以納入外觀、pH 值、含量、鑒別、序列分析、純度、超螺旋比例、生物學活性、無菌檢測、細菌內毒素、雜質殘留等檢測項目。mRNA 類的質量標準可以納入外觀、pH 值、含量、鑒別、序列分析、mRNA 完整性、加帽率、poly（A）長度及分布、生物學活性、無菌檢測、細菌內毒素、雙鏈 RNA 殘留、溶劑殘留等檢測項目。常見的復合核酸類基因修飾系統的質量控制項目包括外觀、pH、顆粒大小及分散系數、滲透壓、鑒別、序列測定、含量/濃度檢測、生物學活性、純度、序列完整性、包封率、復合材料各組分含量（例如脂質鑒別和含量）、游離核酸、可見異物、雜質、微生物安全性等。

方法學研究與驗證方面，基本原則同病毒載體類基因修飾系統的要求。

六、穩定性研究與直接接觸性容器/材料研究

（一）穩定性研究

基因修飾系統如涉及到貯存，則需開展相應的穩定性研究。采用擬貯存階段樣品的代表性批次開展研究，一般包括貯存、運輸（如適用）和使用穩定性研究等。研究開展前， 需統籌制定穩定性研究方案，關注各穩定性研究所用樣品、直接接觸性容器/材料、檢測時間點、檢測條件和分析檢項等。

研究中需對能夠反映質量變化的敏感特征進行研究，如 含量、完整性、純度、微生物安全性和生物學活性等。研究 中需涵蓋擬定的各項條件，如溫度、光照、反復凍融（冷凍 貯存時）、振搖等方面。根據實際使用情況，開展使用中穩 定性研究，例如復溶或解凍，與復溶稀釋劑的相容性等研究。研究中需采用與實際使用相同材質的直接接觸性容器/材料。

對于病毒載體類基因修飾系統，穩定性研究中建議重點 考察病毒載體的滴度、純度、雜質、微生物安全性指標、生 物學活性等關鍵質量屬性。對于非病毒載體類基因修飾系統， 建議重點關注理化特性、結構完整性、雜質等關鍵質量屬性。例如，DNA 超螺旋結構的比例可能影響 DNA 的轉染率， mRNA 加帽率可能影響 mRNA 的結構穩定性和翻譯效率， 建議在穩定性研究中重點考察。

（二）直接接觸性容器/材料研究

如涉及貯存，需對直接接觸的包裝容器開展相應的包材相容性研究。根據相容性研究結果，結合穩定性研究，選擇合理的包裝容器。

另外，對制備工藝中與樣品接觸的容器和一次性使用材料（如貯存袋、過濾膜、層析介質、管路等），需開展風險評估和/或相應的相容性研究。